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Forscher in UniSysCat berechnen hochaktive Enzyme für die Produktion von licht-aktivierbaren Proteinen

Natürliche Proteine können als Blaupause für die Entwicklung von Enzymen mit neuartiger Substratspezifität verwendet werden. Neue Funktionen sind jedoch in der Regel mit einer im Vergleich zu natürlichen Funktionen deutlich geringeren Aktivität verbunden - eine neue Funktion hat also den Preis geringerer Effizienz. Für natürliche katalytische Reaktionen hatte die Natur und Evolution Milliarden Jahre Zeit, optimierte Enzyme zu entwickeln, die auf ihre individuellen Aufgaben abgestimmt wurden. Bei künstlich hergestellten Enzymen, die als speziell entwickelte Biokatalysatoren dringend benötigt werden, stellt sich die Frage, wie dieses Ziel innerhalb der Zeitskalen von Forschungsprozessen erreicht werden kann.

Ein faszinierender Ansatz für die Erzeugung neuartiger Proteine ​​besteht darin, deren Bausteine ​​(die 20 kanonischen Aminosäuren) mit Hilfe des genetischen Codes zu ändern. Dies ermöglicht es, Proteine ​​und Peptide mit nichtkanonischen Aminosäuren mit neuen Funktionalitäten und besonderen Eigenschaften gezielt auszustatten. Die ribosomale Inkorporation von mehr als 200 verschienden solcher Aminosäuren durch Erweiterung des genetischen Codes eröffnet den Weg für ein gezieltes Design von Biomolekülen. Für jede dieser neuen Aminosäuren müssen spezielle an der Proteinsynthese beteiligten Enzyme konstruiert werden - die Aminoacyl-tRNA-Synthetasen. Auch hier ist die Erzeugung effizienter Enzymvarianten für neue Aminosäuresubstrate aufgrund des großen Sequenzraums eine große Herausforderung. Um neue Substratspezifität zu erzielen, auch wenn nur die ausgewählte Aminosäuren variiert werden (z.B. 30 Aminosäuren die strukturell nah am Substrat liegen), wird ein kombinatorischer Raum von 2030 Varianten erreicht, der auf die gewünschte Funktion getestet werden muss. Experimentell können jedoch nur 5-7 Positionen auf genetischer Ebene variiert und getestet werden.

Zur Entwicklung effizienter aaRS-Varianten und zur Überwindung der Einschränkungen vorhandener zielgerichteter Mutagenesebibliotheken, wurde rechnergestütztes Enzymdesign angewendet. Dies ermöglichte die Erzeugung einer fokussierten aaRS-Genbibliothek, die dann experimentell genutzt werden kann. Insgesamt wurden 17 Aminosäuren, auch solche, die weiter vom aktiven Zentrum entfernt sind, in dem Prozess verändert. Nachfolgende Zyklen im Labor mit positiver und negativer aaRS-Selektion führten zur Isolation einer Enzymvariante mit hoher Aktivität für licht-entschützbares (durch Licht aktivierbares) ortho-Nitrobenzyltyrosin (ONBY): das synthetische aaRS-Substrat, das für diese Studie ausgewählte wurde. Die erhaltene aaRS trägt zehn Mutationen und ist aktiver als die zuvor bekannten ONBY-spezifischen Enzyme, die aus traditionellen Bibliotheken isoliert wurden. Die Effizienz des Einbaus der Aminosäure in lebenden Bakterienzellen erreichte das Niveau des Wildtyp-Enzyms. Dies ermöglicht nun die effiziente Herstellung von ONBY-markierten Peptiden und Proteinen, die die synthetische durch Licht aktivierbare Aminosäure tragen.

"Diese Ergebnisse zeigen beispielhaft, wie computergestütztes Design von Proteinen die Erzeugung effizienter Biokatalysatoren erleichtern kann und so zu einer verbesserten allgemeinen Strategie für die Entwicklung von aaRS-Bibliotheken führen kann.", sagte Tobias Baumann, Hauptautor der aktuellen Arbeit.

 

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